La spettrofotometria è una tecnica sperimentale utilizzata per misurare la concentrazione di un soluto in una particolare soluzione calcolando la quantità di luce assorbita da quella sostanza. Questa tecnica è molto utile perché alcuni composti assorbono anche diverse lunghezze d'onda della luce a diverse intensità. Analizzando la luce che passa attraverso una soluzione, è possibile identificare i composti disciolti nella soluzione e le loro concentrazioni. Lo strumento utilizzato per analizzare le soluzioni con questa tecnica in laboratorio è uno spettrofotometro.
Fare un passo
Parte 1 di 3: preparazione del campione
Passaggio 1. Accendere lo spettrofotometro
La maggior parte degli spettrofotometri deve essere riscaldata prima di poter fornire misurazioni accurate. Quindi, avviare la macchina e lasciarla riposare per almeno 15 minuti prima di misurare il campione.
Utilizzare questo tempo per preparare il campione
Passaggio 2. Pulire la cuvetta o la provetta
Nei laboratori scolastici possono essere disponibili provette monouso che non devono essere prima pulite. Tuttavia, se si utilizza una normale cuvetta o provetta, assicurarsi di pulire accuratamente l'apparecchio prima dell'uso. Sciacquare tutte le cuvette con acqua deionizzata.
- Fare attenzione quando si usano le cuvette perché sono piuttosto costose.
- Durante l'utilizzo della cuvetta, non toccare il lato dove passa la luce (di solito il lato trasparente del contenitore).
Passaggio 3. Versare un campione sufficiente nella cuvetta
Il volume massimo di una parte della cuvetta è di 1 ml, mentre il volume massimo della provetta è di 5 ml. Le tue misurazioni dovrebbero essere accurate finché la luce dello spettrofotometro può ancora passare attraverso il campione e non una parte vuota del contenitore.
Se si utilizza una pipetta per inserire i campioni, utilizzare un nuovo puntale per ogni campione. In questo modo è possibile evitare la contaminazione incrociata
Passaggio 4. Preparare la soluzione di controllo
Queste soluzioni, note anche come bianchi o bianchi, contengono solo il solvente nella soluzione da analizzare. Ad esempio, se hai un campione di sale sciolto in acqua, la soluzione in bianco di cui hai bisogno è l'acqua. Se l'acqua che stai usando è rossa, dovresti usare anche una soluzione bianca rossa. Utilizzare un contenitore simile per contenere la soluzione del bianco nello stesso volume del campione.
Passaggio 5. Pulire l'esterno della cuvetta
Prima di inserire la cuvetta nello spettrofotometro, è necessario assicurarsi che sia pulita per evitare interferenze con le misurazioni dovute a particelle di polvere o impurità. Utilizzare un panno privo di lanugine per rimuovere eventuali gocce d'acqua o polvere che aderiscono all'esterno della cuvetta.
Parte 2 di 3: Sperimentazione
Passaggio 1. Determinare e regolare la lunghezza d'onda della luce per analizzare il campione
Utilizzare una singola lunghezza d'onda della luce (raggio monocromatico) per aumentare l'efficacia della misurazione. Scegli il colore della luce che può essere assorbito dal contenuto chimico che si pensa sia disciolto nel campione di prova. Imposta la lunghezza d'onda in base alle specifiche dello spettrofotometro che stai utilizzando.
- Nei laboratori scolastici, queste lunghezze d'onda verranno solitamente fornite nelle istruzioni sperimentali.
- Poiché il campione rifletterà tutta la luce visibile, la lunghezza d'onda del colore della luce sperimentale è solitamente sempre diversa dal colore del campione.
- Un oggetto appare di un certo colore perché riflette una certa lunghezza d'onda e assorbe tutti gli altri colori. L'erba appare verde perché la clorofilla in essa contenuta riflette il verde e assorbe altri colori.
Passaggio 2. Calibrare lo spettrofotometro con una soluzione in bianco
Mettere la soluzione del bianco nel portacuvette e chiudere lo spettrofotometro. Sullo schermo dello spettrofotometro analogico, c'è un ago che si muove in base all'intensità del rilevamento della luce. Dopo aver inserito la soluzione in bianco, l'ago dovrebbe spostarsi verso destra. Registra questo valore nel caso ne avessi bisogno in seguito. Lasciare che la soluzione del bianco rimanga nello spettrofotometro, quindi far scorrere l'ago a zero utilizzando la manopola di regolazione.
- Anche gli spettrofotometri digitali possono essere calibrati allo stesso modo. Tuttavia, questo strumento è dotato di uno schermo digitale. Impostare la lettura della soluzione del bianco a 0 con la manopola di controllo.
- Anche se la soluzione del bianco viene rimossa dallo spettrofotometro, la calibrazione sarà ancora valida. Quindi, quando si misura l'intero campione, l'assorbanza del bianco verrà automaticamente ridotta.
Passaggio 3. Rimuovere il bianco e testare i risultati della calibrazione dello spettrofotometro
Anche dopo che la soluzione del bianco è stata rimossa dallo spettrofotometro, l'ago o il numero sullo schermo dovrebbe ancora leggere 0. Reinserire la soluzione del bianco nello spettrofotometro e assicurarsi che la lettura non cambi. Se lo spettrofotometro è calibrato correttamente utilizzando una soluzione vuota, il risultato sullo schermo dovrebbe essere ancora 0.
- Se l'ago o il numero sullo schermo non indica 0, ripetere i passaggi di calibrazione con una soluzione in bianco.
- Se il problema persiste, chiedi aiuto o chiedi a qualcuno di controllare lo spettrofotometro.
Passaggio 4. Misurare l'assorbanza del campione
Rimuovere la soluzione in bianco e inserire il campione nello spettrofotometro. Attendere circa 10 secondi affinché le lancette si stabilizzino o i numeri sul display digitale smettano di cambiare. Registrare la percentuale di trasmittanza e/o assorbanza del campione.
- Più luce viene trasmessa, meno luce viene assorbita. Solitamente è necessario registrare il valore di assorbanza del campione che è generalmente espresso come numero decimale, ad esempio 0,43.
- Ripetere la misurazione di ogni campione almeno tre volte e poi calcolare la media. In questo modo, i risultati che otterrai saranno più accurati.
Passaggio 5. Ripetere l'esperimento con diverse lunghezze d'onda della luce
Il tuo campione può contenere diversi composti che hanno assorbanze diverse a seconda della lunghezza d'onda della luce. Per ridurre l'incertezza, ripetere le misurazioni del campione a intervalli di lunghezza d'onda di 25 nm attraverso lo spettro luminoso. In questo modo è possibile rilevare altre sostanze chimiche disciolte nel campione.
Parte 3 di 3: analisi dei dati di assorbimento
Passaggio 1. Calcolare la trasmittanza e l'assorbanza del campione
La trasmittanza è quanta luce può passare attraverso il campione e raggiungere lo spettrofotometro. Nel frattempo, l'assorbanza è la quantità di luce assorbita da una delle sostanze chimiche disciolte nel campione. Ci sono molti spettrofotometri moderni che danno risultati sotto forma di trasmittanza e assorbanza. Tuttavia, se ottieni un valore di intensità della luce, puoi anche calcolare questi due valori da solo.
- La trasmittanza (T) può essere determinata dividendo l'intensità della luce che passa attraverso la soluzione del campione per la quantità di luce che passa attraverso la soluzione del bianco. Questo valore è solitamente espresso come numero decimale o percentuale. T = io/io0, dove I è l'intensità del campione e I0 è l'intensità del vuoto.
- L'assorbanza (A) è espressa come trasmittanza (esponente) del logaritmo in base 10 negativa: A = -log10T. Quindi, se T = 0, 1, A = 1 (0, 1 è 10 alla potenza di -1). Ciò significa che il 10% della luce viene passato, mentre il 90% viene assorbito. Nel frattempo, se T= 0,01, A = 2 (0,01 è 10 alla potenza di -2). Ciò significa che la luce che viene trasmessa è dello 0,1%.
Passaggio 2. Rappresentare graficamente il valore di assorbanza rispetto alla lunghezza d'onda
Esprimere il valore di assorbanza come l'asse y e la lunghezza d'onda come l'asse x. Dai punti di tutti i risultati di assorbanza in ciascuna lunghezza d'onda, otterrai lo spettro di assorbanza del campione e identificherai il contenuto del composto e il suo rapporto nel campione.
Gli spettri di assorbanza di solito hanno picchi a determinate lunghezze d'onda. Queste lunghezze d'onda di picco consentono di identificare composti specifici
Passaggio 3. Confronta il tuo spettro di assorbanza con un grafico di un composto noto
Ogni composto ha uno spettro di assorbanza unico e ha sempre la stessa lunghezza d'onda di picco in ogni misurazione. Confrontando il grafico che si ottiene con un grafico di un determinato composto noto, è possibile identificare il contenuto di soluto nella soluzione del campione.
