La colorazione di Gram è una tecnica rapida e viene utilizzata per vedere la presenza di batteri in un campione di tessuto e per classificare i batteri come Gram-positivi o Gram-negativi, in base alle proprietà chimiche e fisiche delle loro pareti cellulari. La colorazione di Gram è quasi sempre utilizzata come primo passo nella diagnosi di un'infezione batterica.
Questa tecnica di colorazione prende il nome dallo scienziato danese Hans Christian Gram (1853 - 1938), che sviluppò la tecnica nel 1882 e la pubblicò nel 1884 come tecnica per distinguere tra due tipi di batteri con sintomi clinici simili: Streptococcus pneumoniae (noto anche come Streptococcus pneumoniae). pneumococchi) e il batterio Klebsiella pneumoniae.
Fare un passo
Metodo 1 di 3: Preparazione del vetrino per microscopio
Passaggio 1. Prepararsi a lavorare in laboratorio
Indossare guanti e un elastico per capelli lungo per prevenire la contaminazione batterica del campione che si sta testando. Pulisci l'area di lavoro sotto una cappa aspirante o in un'altra area ben ventilata. Controlla il becco Bunsen e assicurati che il microscopio funzioni correttamente prima di iniziare.
Passaggio 2. Sterilizzare il vetrino del microscopio
Se il vetrino è sporco, lavarlo con acqua e sapone per rimuovere olio e sporco. Pulisci i vetrini con etanolo, detergente per vetri o un altro metodo utilizzato dal tuo laboratorio.
Passaggio 3. Posizionare il campione sul vetrino
È possibile utilizzare la tecnica della colorazione di Gram per identificare i batteri in un campione medico o una coltura di batteri che crescono in una capsula di Petri. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare la colorazione di Gram su tratti sottili del campione. Si consiglia di utilizzare campioni di età inferiore a 24 ore, poiché i batteri più vecchi potrebbero aver danneggiato le pareti cellulari e potrebbero non rispondere alla colorazione di Gram.
- Se si utilizza un campione di tessuto, aggiungere 1-2 gocce su un vetrino. Distribuire uniformemente sul vetrino per formare un sottile strato di campione spruzzato, facendolo scorrere utilizzando il bordo dell'altro vetrino sterile. Lascia asciugare prima di eseguire il passaggio successivo.
- Se stai prelevando batteri da una capsula di Petri, sterilizza l'ansa di inoculazione in un becco Bunsen finché non si illumina, quindi lascia che si raffreddi. Utilizzare l'ansa per gocciolare acqua sterile sul vetrino, quindi sterilizzare e raffreddare nuovamente prima di utilizzarlo per raccogliere un piccolo campione di batteri. Dopodiché mescola delicatamente.
- I batteri preparati nel brodo devono essere nuovamente agitati con un vortex, quindi prelevati con l'ansa di inoculazione come sopra, senza aggiungere acqua.
- Se hai un campione di tampone (di solito fatto con un piccolo manico con punta di cotone), tocca e ruota delicatamente il tampone sul vetrino.
Passaggio 4. Una temperatura leggermente elevata può fare una buona sbavatura
Il calore manterrà i batteri sulla parte superiore del vetrino, in modo che non si dissolvano facilmente durante il processo di colorazione. Battere rapidamente il vetrino due o tre volte su un becco Bunsen o riscaldare il vetrino su un riscaldatore elettrico. Non surriscaldare, il campione potrebbe danneggiarsi. Se stai usando un becco Bunsen, dovrebbe essere una fiamma piccola ma blu invece di una grande fiamma arancione.
In alternativa, si può fare anche uno striscio con metanolo, aggiungendo 1-2 gocce di metanolo ad uno striscio secco, asciugando il restante metanolo sul vetrino lasciandolo all'aria aperta. Questa tecnica riduce al minimo il danno cellulare e fornisce uno sfondo pulito dell'immagine della diapositiva
Passaggio 5. Posizionare la diapositiva sul vassoio da colorare
I vassoi per colorazione sono realizzati in metallo, vetro o lastre di plastica poco profonde con una morbida rete che riveste la parte superiore. Posiziona i vetrini sopra queste reti, in modo che il liquido che usi possa essere drenato nel vassoio.
Se non hai un vassoio da colorare, puoi posizionare un vetrino su un vassoio di plastica per stampare cubetti di ghiaccio
Metodo 2 di 3: Processo di colorazione di Gram
Passaggio 1. Versare il liquido cristalvioletto sullo striscio
Usa una pipetta per spruzzare un campione di batteri con alcune gocce di colorante cristalvioletto, noto anche come violetto di genziana. Lascialo per 30-60 secondi. Il cristalvioletto (KV) si separa in soluzione acquosa in ioni KV+ e cloruro (Cl-). Questi ioni penetrano nelle pareti cellulari e nelle membrane cellulari dei batteri sia gram-positivi che gram-negativi. Lo ione KV+ interagisce con i componenti caricati negativamente delle cellule batteriche, conferendo alle cellule un colore viola.
Molti laboratori usano il cristalvioletto "Hucker", che contiene ossalato di ammonio per prevenire le precipitazioni
Passaggio 2. Sciacquare delicatamente il Cristalvioletto
Inclinare il vetrino e utilizzare un flacone di lavaggio per spruzzare un piccolo flusso di acqua distillata o del rubinetto sul vetrino. L'acqua dovrebbe scorrere sulla superficie della macchia e non dovrebbe essere spruzzata direttamente sulla macchia. Non risciacquare eccessivamente. Può rimuovere la colorazione nei batteri Gram-positivi.
Passaggio 3. Sciacquare lo striscio con iodio, quindi risciacquare
Utilizzare un contagocce per lavare lo striscio con iodio. Lasciare agire per almeno 60 secondi, quindi risciacquare accuratamente come sopra Lo iodio, sotto forma di ione con carica negativa, interagisce con KV+ per formare un grande complesso composto tra Cristalvioletto e iodio (complesso composto CV-I) negli strati interno ed esterno della cellula. Questo complesso di composti manterrà il colore viola del cristalvioletto all'interno della cellula, nei punti macchiati.
Lo iodio è una sostanza corrosiva. Evitare l'inalazione, l'ingestione o il contatto con la pelle
Passaggio 4. Aggiungere la candeggina colorata, quindi risciacquare rapidamente
Una miscela 1:1 di acetone ed etanolo viene solitamente utilizzata per questo importante passaggio, che deve essere accuratamente cronometrato. Posizionare il vetrino con una certa angolazione, quindi aggiungere candeggina colorata fino a quando non è più visibile il viola nell'acqua utilizzata per il risciacquo. Questo di solito richiede meno di 10 secondi, o anche meno tempo se la candeggina contiene un'alta concentrazione di acetone. Interrompi immediatamente questo passaggio, altrimenti il colorante percola anche il cristalvioletto dalle cellule gram-positive e negative e il processo di colorazione deve essere ripetuto. Risciacquare immediatamente la decolorazione in eccesso utilizzando la tecnica precedente.
- L'acetone puro (95%+) può essere usato come sostituto. Più acetone usi, più velocemente la candeggina funzionerà, quindi devi prestare più attenzione ai tempi.
- Se hai problemi a tenere traccia del tempo per questo passaggio, aggiungi la candeggina del colore goccia a goccia.
Passaggio 5. Cospargere il colorante in contrasto sullo striscio, quindi risciacquare
Una controcolorazione, solitamente safranina o fucsina, viene utilizzata per aumentare il contrasto tra batteri gram-negativi e gram-positivi, colorando batteri decolorati (decolorati), cioè batteri gram-negativi, rosa o rosso. Lasciare agire per almeno 45 secondi, quindi risciacquare.
La fucsina colora intensamente molti batteri gram-negativi, come Haemophilus spp e Legionella spp. Questo metodo va bene per i principianti
Passaggio 6. Asciugare il vetrino
Puoi asciugarli all'aria aperta per asciugarli, o asciugarli usando carta bibulosa venduta per questo scopo. Il processo di colorazione di Gram è completo.
Metodo 3 di 3: Controllo dei risultati della colorazione
Passaggio 1. Preparare il microscopio ottico
Posizionare il vetrino sotto il microscopio. I batteri variano notevolmente in termini di dimensioni, quindi l'ingrandimento totale richiesto varierà da 400x a 1000x. Si consiglia un obiettivo con olio da immersione per un'immagine più nitida. Far cadere l'olio da immersione sul vetrino, evitando movimenti durante il gocciolamento per evitare la formazione di bolle Spostare l'impugnatura della lente del microscopio in modo che la lente dell'obiettivo scatti in posizione e tocchi l'olio.
L'immersione in olio può essere utilizzata solo su lenti appositamente progettate, non su lenti "asciutte"
Passaggio 2. Cerca di identificare i batteri gram-positivi e gram-negativi
Esaminare il vetrino al microscopio ottico. I batteri Gram-positivi appaiono di colore viola, perché il cristalvioletto è intrappolato all'interno della spessa parete cellulare. I batteri Gram-negativi saranno di colore rosa o rosso, perché il cristalvioletto viene risciacquato attraverso le sottili pareti cellulari, dove entra il controcolorante rosa.
- Se il campione è troppo spesso, il risultato potrebbe essere un falso positivo. Colora un nuovo campione se mostra tutti i batteri gram-positivi, per assicurarti che il risultato sia corretto.
- Se usi troppa candeggina, il risultato può essere un falso negativo. Colora un nuovo campione se mostra tutti i batteri gram negativi, per assicurarti che il risultato sia corretto.
Passaggio 3. Confronta i risultati che vedi con l'immagine di riferimento
Se non sai che aspetto hanno i batteri, studia la raccolta di immagini di riferimento, solitamente ordinate per forma e colorazione di Gram. È inoltre possibile visualizzare i database online su [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos e molti altri siti online. Per facilitare l'identificazione, di seguito sono riportati esempi di batteri comunemente riscontrati o importanti per la diagnosi, classificati in base al loro stato e forma Gram.
Passaggio 4. Identifica i batteri gram-positivi in base alla loro forma
I batteri sono ulteriormente classificati in base alla loro forma al microscopio, più comunemente come cocchi (sferici) o bastoncelli (cilindrici). Ecco alcuni esempi di batteri gram-positivi (di colore viola) in base alla loro forma:
- Cocchi Gram-positivi di solito stafilococchi (che significa cocchi di gruppo) o streptococchi (che significa cocchi a catena).
- " Bacilli Gram positivi come Bacillus, Clostridium, Corynebacterium e Listeria. I batteri dei bastoncelli Actinomyces spp. di solito hanno rami o filamenti.
Passaggio 5. Identificare i batteri gram negativi
I batteri Gram-negativi (di colore rosa) sono spesso classificati in tre gruppi. I cocchi sono di forma sferica, i bastoncini sono lunghi e sottili, mentre i bastoncini coccoidi si trovano nel mezzo.
- Cocchi Gram-negativi Il più comune è Neisseria spp.
- Bastoncini Gram-negativi ad esempio E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas e molti altri. Vibrio cholerae può essere visto come uno stelo regolare o uno stelo piegato.
- Bacilli Gram-negativi "coccoidi" (o "coccobacilli") ad esempio Bordetella, Brucella, Haemophilus e Pasteurella
Passaggio 6. Controllare attentamente se i risultati sono contrastanti
Alcuni batteri sono difficili da colorare con precisione, a causa della fragilità o della natura cerosa delle loro pareti cellulari. Questi batteri possono mostrare una miscela di viola o rosa nella stessa cellula o tra cellule diverse nello stesso striscio. I campioni batterici più vecchi di 24 ore possono mostrare questo problema, ma ci sono anche alcune specie batteriche che rimangono difficili da colorare a qualsiasi età di campionamento. Questi batteri richiedono test più specializzati per l'identificazione, come la colorazione acido-resistente, l'osservazione in colture batteriche, terreni di coltura TSI o test genetici.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium e Propionibacterium spp. tutti sono batteri gram-positivi, ma spesso non sono chiaramente colorati.
- Batteri piccoli e sottili come Treponema, Chlamydia e Rickettsia spp. difficile da colorare con il metodo Gram.
Passaggio 7. Smaltire eventuali materiali di consumo e attrezzature rimanenti
Questa procedura di smaltimento dei rifiuti varia tra i laboratori e dipende dai materiali utilizzati. In genere, il liquido nel vassoio di colorazione viene smaltito in bottiglie etichettate come rifiuti pericolosi. Immergere i vetrini in una soluzione di candeggina al 10%, quindi gettarli in un contenitore per oggetti taglienti.
Suggerimenti
- Ricorda che i risultati della colorazione di Gram saranno buoni solo se il campione è buono. È importante informare i pazienti in modo che possano fornire un buon campione (p. es., la differenza tra sputare e una tosse profonda per ottenere un campione di espettorato).
- Come candeggina, l'etanolo reagisce più lentamente dell'acetone.
- Rispettare le norme di laboratorio standard per garantire la sicurezza.
- Usa un tampone sulla guancia per esercitarti, perché contiene sia batteri gram-positivi che gram-negativi. Se vedi un solo tipo di batteri, potresti aver usato troppa o poca candeggina.
- Puoi usare fermagli di legno per fissare la diapositiva.
Avvertimento
- L'acetone e l'etanolo sono sostanze infiammabili. L'acetone rimuoverà l'olio dalle mani, facilitando l'assorbimento di altre sostanze chimiche da parte della pelle. Indossare guanti e usarli con cura.
- Non lasciare che lo striscio si asciughi prima di aver risciacquato la macchia di Gram o di contrasto.
Quello di cui hai bisogno
- Esempio di rete
- Vetrino
- Pipetta
- Piccola fonte di fuoco, riscaldatore per vetrini o metanolo
- Acqua
- Cristallo viola
- Iodio
- Candeggina colorata, come alcol o acetone
- Safranin
